作为新冠疫苗的载体，mRNA 脂质纳米颗粒（LNP，Lipid Nanoparticle）已经获得了巨大的成功。LNP 组分的选择，特别是可离子化的脂质分子能够有效地将转录 COVID-19 病毒刺突蛋白的 mRNA 递送至抗原呈递细胞内，以完成人体对于免疫性抗原的高效识别。
LNP 体系还被广泛应用于癌症疫苗、寡核苷酸及基因编辑工具的体内递送。现有 LNP 疫苗和药物的获批上市为、LNP 药物的开发及临床实验提供了动力。
与此同时，业内仍缺乏能够完全表征 LNP 产品质量和物理特性的技术，其中就包括 LNP 的单颗粒载药量及载药分布特性。
研究 LNP 产品的相关物理特性，可给探究 LNP 的递送效果因素提供关键的线索。比如：单个纳米颗粒可以装载多少个 mRNA 分子；尺寸更大的纳米颗粒是否可以装载更多的 mRNA；是否每一个纳米颗粒都装载了 mRNA 分子；如果不是，空的 LNP 对这一递送体系的生物学效应会产生什么影响。
很多已经发表的论文暗示装载特性可能会显著影响药效动力学和药代动力学，例如：是否装载更多 mRNA 的 LNP 能在单细胞层面引起更强、更持久的 mRNA 表达等。
这些问题也会自然地衍生出工程研发方面的需求，即如何制备载药量可控的纳米颗粒以顺应不同的应用需求。且这些问题都聚焦于一个业内公认的挑战：如何准确、定量地表征单个 LNP 纳米颗粒的组分和载药量。
目前最常用的冷冻电镜、小角度中子散射、核磁共振、纳米颗粒示踪等表征方法，都不能在单个纳米颗粒层面区分装载有 mRNA 和没有装载 mRNA 的 LNP，也不能在 LNP 内分辨出 mRNA 的数量。
另一方面，美国食品和药品监督管理局（FDA，Food and Drug Administration）在 2021 年发表评论，呼吁生物技术公司在开发新型药物时向 FDA 汇报可靠的质量控制参数。
随着越来越多基于纳米颗粒的体系被应用于体内药物递送，目前学界和业界的研究普遍提供间接的表征（如尺寸、表面电位、核酸包封效率等）。这不能令监管者和研究者信服。因此，开发新的对纳米颗粒更直接的表征方法对临床转化产品做出细致的理化分析将使这一领域受益。
为应对这一挑战，约翰霍普金斯大学机械工程系王泽辉教授课题组博士生李思轩、约翰霍普金斯大学医学校生物医学工程系毛海泉教授课题组博士后研究员胡一宗开发出多颜色柱面光激发共聚焦光谱表征技术（CICS，Cylindrical Illumination Confocal Microscopy）。
该表征技术独有的激发光一维柱面光变形特性使其能均匀激发通过检测面的荧光分子，并达到单分子水平的检测灵敏度和接近 100% 的质量检测效率。
通过对 mRNA LNP 中不同组分进行不同颜色的荧光标记，并分析检测到的纳米颗粒信号的颜色成分并分类，这一技术可以分辨出一个剂型中装载或未装载 mRNA 的纳米颗粒。
同时，通过对检测到的来源于 mRNA 的荧光信号进行强度分析和统计，并使用去卷积算法，可以定量计算出每一个 LNP 颗粒中 mRNA 的装载量以及整个剂型的颗粒中 mRNA 装载量的分布。
相关论文在今年九月份以《mRNA 脂质纳米颗粒的载量及载量分布》（Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles）为题发表在期刊 Nature Communications [1]上，并在上线两个月内已获得超过一万两千次的下载阅读量。
（来源：Nature Communications）
实现对 mRNA 脂质纳米颗粒载荷的定量表征
为实现对 mRNA 脂质纳米颗粒载荷的定量表征。该团队首先将一种研究领域中常见的 mRNA LNP 剂型作为样本进行了研究，发现在 LNP 颗粒中的 mRNA 装载量平均数为每个纳米颗粒 2.8 条 mRNA，而且多数有载荷的纳米颗粒装载了 2 或 3 条 mRNA。
图 | 约翰霍普金斯大学博士生李思轩（左）和博士后研究员胡一宗（右）（来源：资料图）
更重要的是，该体系内存在多于半数的没有载荷的空脂质纳米颗粒。据胡一宗描述：“通过一系列控制变量实验，我们发现制备 mRNA LNP 的过程中的多个因素会影响这些装载量分布特性，特别是聚乙二醇（PEG，Polyethylene Glycol）化的脂质分子的用量和总脂质分子对 mRNA 的质量比。”
有多个先前发表的文章表明，调低 PEG 脂质分子的用量增加了 LNP 的尺寸。该成果证实了通过该方法获得的增大尺寸的 LNP 确实提高了 mRNA 的载荷量。
“我们相信这些新知识将引起学术界和产业界关于 LNP 制备的思考，并推进对 LNP 体系的进一步优化。”胡一宗说。
图 | 多颜色柱面光激发共聚焦光谱表征技术对脂质纳米颗粒的数据表征（来源：Nature Communications）
课题组的另一个发现是 mRNA LNP 在制备过程中展现出的动态变化特性。LNP 制备流程是在低 pH 条件下将带正电的可离子化脂质分子、辅助脂质分子、胆固醇与带负电的 mRNA 混合形成纳米颗粒。然后，通过透析和纯化的方式将颗粒介质转化为生理盐水（pH7.4）。
这一过程中，可离子化脂质分子因去质子化而变得完全疏水。这会使 LNP 的结构产生很大变化。研究者对透析前和透析后 LNP 的分析表明：mRNA 载荷的特性并非一开始在低 pH 条件下就已经固定，而是在透析过程中发生了基于纯化条件的变化。
李思轩评论道：“这些变化具有一定的复杂性，但我们对 CICS 输出数据的仔细分析表明其遵循简单的动力学机理。这一发现提示我们生产工艺可能对 mRNA LNP 的载荷特性有显著影响。”
图 | mRNA 脂质纳米颗粒有效载荷的确定机制和分配（来源：Nature Communications）
对于开发下一代 mRNA 脂质纳米颗粒递送体系至关重要
据介绍，这一研究是王泽辉和毛海泉的又一次成功合作。
2021 年初正值 mRNA 脂质纳米颗粒疫苗在新冠疫情中得到广泛应用。尽管材料在应用上取得了巨大成功，但两位研究者在细致讨论相关文献后发现还有很多机理性的问题亟需解答。
受益于两实验室的强大平台技术和理论支撑，以及两位教授和学生间的良好沟通，两人迅速完成了针对纳米颗粒载量研究的可行性分析，设计出了完整的实验，并在一年内推进并完成了所有数据收集。
文章在 2022 年初成稿并投稿至 Nature Communications 后经历了九个月的审稿周期。
三位审稿人都对论文中的“存在没有装载 mRNA 的空纳米颗粒”这一结论表现出浓厚兴趣。面对其中一位审稿人对该数据的评论，课题组还额外补充了超分辨共聚焦荧光显微实验，定性验证了这些空纳米颗粒的存在。
李思轩回忆道：“根据审稿人的反馈，我们增加了很多实验并就很多实验数据进行了更为详尽的解释，我们也希望这可以为诸多同行和广泛的读者们提供更完整的视角。这次非常有挑战性的与审稿人的沟通对我们来说也是一次很有价值的学习。”
文章发表时，审稿人评价道：“这是一篇有说服力的论文，其展现的结果对于开发下一代 mRNA 脂质纳米颗粒递送体系将非常重要。”
胡一宗回忆说：“基于实验结果创造一整个知识体系的实践让我们感觉非常有成就感，也迫不及待地想要和整个领域去分享这些知识。”
此外，该研究也受到业界专家的高度评价。宾夕法尼亚大学生物工程系 Skirkanich 助理教授、mRNA 脂质纳米颗粒专家迈克尔·米切尔（Micheal Mitchell）在接受约翰霍普金斯大学新闻团队采访时表示：“该研究成果对于医药领域的贡献巨大。FDA 近期明确呼吁纳米医药产品应提供详细的质量控制参数数据。
不仅如此，mRNA 脂质纳米颗粒体系将更多地在疫苗以外的应用场景中使用，比如静脉注射。这也对纳米颗粒的性质有严格的要求。王教授和毛教授研发的表征平台对这些需求有推动作用。”
对 mRNA 脂质纳米颗粒 LNP 载荷量的成功表征，也表明这一技术平台可以应用于其他纳米药物体系。对制备的功能性纳米颗粒进行详细表征不仅有助于理解结构和功能的对应关系，从而设计出更有效的递送体系，同时也是进行临床转化及获得监管授权的重要步骤。
目前，该课题组正在推进的方向有：对包括 mRNA LNP 在内的各类脂质纳米颗粒进行更加深入的组装机理研究，以及对基于纳米颗粒的小分子及蛋白缓释体系的机理研究。
参考资料：
1.Li S, Hu Y, Li A. et al. Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles. Nature Communications13，5561（2022）. https://doi.org/10.1038/s41467-022-33157-4
2.https://inbt.jhu.edu/molecular-detection-platform-provides-new-insights-into-gene-medicine-manufacturing/